Отто Рем (справа) впервые применил ферменты в кожевенном производстве, а также как добавку к моющим средствам. Апробация предложенного Ремом метода дубления кож.
Первое моющее средство «Burnus» с биодобавками появилось в 1914 г. В качестве активных биодобавок использованы ферменты животного происхождения. Однако свое триумфальное шествие «биомоющие» средства начали лишь после того, как стало возможным получать биотехнологическим способом дешёвые и устойчивые в мыльном щелоке ферменты микробов. (На плакате надпись: «„Burnus“ чудесно стирает бельё».)
Принцип «работы» биомоющих средств (вверху). Сравнение эффективности обычных и «биологических» моющих средств (внизу).
В некоторых странах препарат протеазы продаётся также в качестве «размягчителя» мяса (тендеризатор; от англ. tender — нежный). Им посыпают мясо за несколько часов до приготовления. Ферменты расщепляют жёсткие мышечные белки мяса и делают его нежным и сочным. Кстати, имеются и косметические средства для ухода за кожей, содержащие протеазы. При пользовании ими кожа становится свежей и розовой. Разумеется, эти мыла и кремы содержат совершенно ничтожные количества фермента!
В кожевенной промышленности протеазы микробного происхождения применяют для удаления со шкур волос и щетины и для дубления кож. Ранее для дубления применяли фекалии животных. Это была очень неприятная работа. И вот сегодня открыт секрет этого процесса: полезные свойства экскрементов, благодаря которым они использовались для дубления кож и удаления со шкур волос, основаны на том, что содержащиеся в них микробы выделяют протеазы.
В молочной промышленности также «работают» микробные протеазы: они расщепляют белок молока казеин, так как в связи с резко возросшим производством сыра сычужный фермент становится всё менее доступным. Однако методами генной инженерии уже получены такие бактерии, которые продуцируют в биореакторах сычужный фермент животных. В сельском хозяйстве протеазы примешивают к животному корму, для того чтобы сделать его более усвояемым.
Воздействуя протеазами на отходы переработки рыбы, можно отделить белок «до костей» и превратить его в смесь аминокислот — отличная добавка к корму для скота.
Область применения ферментов, расщепляющих белки, далеко не исчерпана вышесказанным. Разумеется, предпосылкой к этому является мощная биотехнологическая промышленность, способная дёшево и в больших количествах вырабатывать ферменты из микробов. Биотехнологи ведут интенсивный поиск таких микроорганизмов, которые продуцируют очень активные и стабильные ферменты. В качестве таких «рабочих лошадок» наиболее перспективны прежде всего микроорганизмы, выживающие в экстремальных условиях — в горячих вулканических источниках, в оттоках из рудных или серных источников, в бассейнах для добывания соли методом осаждения, в которых испаряется морская вода и остаётся кристаллическая поваренная соль, или же на морском дне под высоким давлением.
Однако часто даже не требуется снаряжать экспедиции к далеким вулканам для того, чтобы отыскать такие «живучие» микроорганизмы. В ГДР в Лейпцигском институте биотехнологии в «титане» с горячей водой были обнаружены бактерии, которые имели наибольшую активность при температурах между 75 и 92 °С.
Как же получают ферменты из микробов? Если речь идёт о протеазах и амилазах, то относительно просто: микробы, в частности штаммы Bacillus или леечной плесени Aspergillus, выращивают в белковых или крахмальных смесях. Затем побуждают микроорганизмы к усиленному выделению в окружающую жидкость протеаз, расщепляющих белки, или амилаз, расщепляющих крахмал. После отделения микробных клеток получают смесь непотреблённых питательных веществ и выделенных ферментов. Посредством центрифугирования тяжёлые молекулы, в данном случае ферменты, осаждаются в виде концентрированного донного осадка. Потребителям они отпускаются либо в жидком виде, либо в форме высушенного порошка.
Ферменты «на привязи»
«Переваривание» крахмала амилазами применяется при промышленном производстве виноградного сахара (глюкозы). Виноградный сахар получил своё название от винограда, в котором был найден впервые. В качестве строительного «блока» он содержится в свекловичном сахаре, молочном сахаре и крахмале.
Для получения виноградного сахара сначала распускают в воде белый безвкусный порошок кукурузного или картофельного крахмала, варят крахмальный клейстер и кипятят его несколько часов. Это делается для того, чтобы облегчить амилазам доступ к оптимальным участкам воздействия в молекуле крахмала. При температурах 35—60 °С к крахмальному клейстеру добавляют микробные амилазы. Через короткий срок весь крахмал разлагается до глюкозы, которую остаётся только очистить и высушить.
Однако в этом процессе имеется одна «загвоздка»: как и в случае с моющими средствами, ферменты могут быть использованы только единожды. И это очень досадно! Ведь они были бы в состоянии расщепить много больше крахмала, чем в этом одноразовом процессе. Однако пока что не удаётся разработать дешёвый способ извлечения ферментов из концентрированных сахарных растворов с целью повторного применения.
И вот в связи с этим в начале шестидесятых годов биотехнологам пришла в голову блестящая идея: они решили попробовать прикрепить ферменты к довольно большим, видимым невооружённым глазом шарикам таким образом, чтобы они могли по-прежнему исполнять свои функции, подобно тому как собака, посаженная на цепь, может по-прежнему лаять, а при случае и укусить. Такие ферменты уже не мобильны, то есть они не могут свободно перемещаться в растворе. Про подобные закреплённые молекулы говорят, что они иммобилизованы (неподвижны). Поэтому новый метод работы был назван методом с иммобилизованными ферментами.
Например, ферменты могут быть иммобилизованы путём химического связывания со стеклом или полимером в случае использования стеклянных или пластмассовых шариков; иммобилизация ферментов может заключаться также в том, что ферментные молекулы включаются в поры полимерных материалов. «Бегство» молекул ферментов и в том и в другом случаях становится невозможным. Шарики или пористые частицы имеют такие размеры, что могут быть без труда с помощью фильтров грубой очистки вновь выделены из биореакторов. После недолгого отмывания их можно опять применить в новом процессе; более того, многие ферменты в результате иммобилизации становятся даже стабильней, так как, располагаясь в порах губчатых материалов, они обретают защиту от разрушения «прожорливыми» микробами.
Сравнение эффективности применения растворимых амилаз и амилаз, адсорбированных (иммобилизованных) на пористых стеклянных шариках, для получения глюкозы из крахмала.
Теперь посмотрим, как применяются иммобилизованные ферменты в промышленности.
Например, амилазы, расщепляющие крахмал до виноградного сахара, иммобилизуют на пористых стеклянных шариках: они становятся прочно закреплёнными на поверхности шариков и в их порах. Иммобилизованные таким образом ферменты (то есть стеклянные шарики, «содержащие» ферменты) загружают в большую стальную колонну биореактора. Через биореактор пропускают очищенный раствор крахмала. Амилазы, иммобилизованные на стеклянных шариках, расщепляют протекающий крахмал до глюкозы. Специально установленное сито препятствует тому, чтобы шарики покидали реактор вместе с раствором глюкозы. Такой проточный реактор может работать месяцами, пока не будут исчерпаны (то есть так или иначе потеряны в результате растворения, разрушения и т. д.) до конца все амилазы или пока в биореакторе не поселятся вредные микробы.
